Electroforeza acizilor nucleici

Electroforeza în gel separă fragmente de ADN sau ARN după felul în care migrează într-un câmp electric. Acizii nucleici au sarcină negativă, astfel că se deplasează spre polul pozitiv. Rețeaua gelului încetinește fragmentele mari mai mult decât pe cele mici; acestea din urmă ajung, în general, mai departe în același interval. Probele se pun în godeuri, iar un marker cu fragmente de dimensiuni cunoscute permite estimarea dimensiunii benzilor obținute.

O bandă pe gel nu spune singură ce secvență exactă are fragmentul. Două fragmente de aceeași dimensiune pot avea baze diferite. Înainte de a interpreta rezultatul, verifică sensul migrării, poziția godeurilor, markerul și controalele. Dacă un fragment obținut prin PCR are dimensiunea așteptată, aceasta susține că amplificarea a produs un fragment potrivit ca lungime, dar pot fi necesare alte verificări pentru identitate. Nu confunda intensitatea benzii cu o măsură exactă a concentrației fără calibrare. Lecțiile Amplificarea ADN prin PCR, Secvențierea ADN și Acizii nucleici oferă contextul producerii, identificării și structurii fragmentelor analizate.

Agaroza este folosită frecvent pentru fragmente de ADN de dimensiuni moderate. Migrarea depinde de dimensiune, conformație, concentrația gelului și condițiile tamponului. Markerul de masă moleculară permite estimarea lungimii, iar colorația face benzile vizibile. Electroforeza capilară folosește alt suport și poate oferi rezoluție mai mare. Identitatea unei secvențe se confirmă prin metode specifice, nu numai prin lungime.

În gelul de agaroză, ADN-ul încărcat negativ migrează spre electrodul pozitiv, iar fragmentele mai scurte parcurg de regulă o distanță mai mare. O scară de fragmente cu dimensiuni cunoscute permite estimarea benzilor probei. De exemplu, o bandă la aceeași poziție cu reperul de 500 perechi de baze sugerează o dimensiune apropiată, nu o secvență identică.

Gelul de agaroză se pregătește în tampon (TAE sau TBE), iar concentrația lui depinde de dimensiunea fragmentelor: aproximativ 0,8% pentru fragmente mari (1–10 mii de perechi de baze) și 2% pentru fragmente mici (sub 1 000 de perechi de baze). Probele sunt amestecate cu un colorant de încărcare, care le îngreunează să coboare în godeu și arată înaintarea frontului, apoi se aplică un câmp electric de aproximativ 5–10 V pe centimetru. Distanța parcursă este aproximativ proporțională cu logaritmul zecimal al lungimii fragmentului, cu semn negativ: fragmentele mai lungi migrează mai puțin. Benzile devin vizibile prin intercalarea unui colorant fluorescent în ADN, sub lumină ultravioletă sau albastră. Se folosesc colorații mai puțin toxice decât bromura de etidiu, care este mutagenă.

Exemplu rezolvat 1: estimarea lungimii unui fragment. Markerul conține benzi de 1 000, 500 și 250 de perechi de baze, care au migrat 20 mm, 32 mm și 44 mm. O bandă a probei a migrat 38 mm.

1. Fiecare înjumătățire a lungimii deplasează banda cu 12 mm ($32-20=12$; $44-32=12$).
2. Proba se află între 500 (32 mm) și 250 (44 mm), exact la jumătate din interval: $38-32=6$ mm, adică jumătate din 12 mm.
3. Lungimea: $500\cdot 2^{-6/12}=500\cdot 2^{-0,5}\approx 354$ perechi de baze.
4. Concluzie: fragmentul are aproximativ 350 de perechi de baze, iar rezultatul este o estimare.

Exemplu rezolvat 2: digestie cu enzimă de restricție. O plasmidă circulară de 5 000 de perechi de baze este tăiată cu EcoRI la pozițiile 800 și 3 100.

1. Fragmentele: $3100-800=2300$ de perechi de baze și $5000-2300=2700$ de perechi de baze.
2. Pe gel apar două benzi, la ale căror poziții corespund 2 300 și 2 700 de perechi de baze, cu banda de 2 700 mai aproape de godeu.
3. Plasmida netăiată, supraspiralizată, migrează altfel decât forma liniară, deci, pentru comparație, se încarcă și o probă netratată.

Greșeli frecvente

• Greșit: ADN-ul migrează spre electrodul negativ.
  Corect: ADN-ul, încărcat negativ, migrează spre electrodul pozitiv.
• Greșit: Două benzi de aceeași lungime au sigur aceeași secvență.
  Corect: Lungimea identică nu stabilește ordinea bazelor.
• Greșit: Fragmentele mai lungi ajung mai departe, fiindcă sunt mai încărcate negativ.
  Corect: Încărcătura pe unitatea de lungime este aceeași; fragmentele mari sunt frânate mai mult de rețeaua gelului și migrează mai puțin.

Înainte și după