Amplificarea ADN prin PCR

PCR este o metodă de laborator prin care o regiune aleasă de ADN este copiată de foarte multe ori. Cercetătorul pornește de la un eșantion de ADN, doi primeri care delimitează regiunea, nucleotide și o ADN-polimerază rezistentă la temperaturi ridicate. Aparatul schimbă repetat temperatura. Mai întâi cele două catene se separă, apoi primerii se leagă de secvențele complementare, iar polimeraza extinde noile catene. Repetarea ciclului crește cantitatea de fragment țintă.

PCR nu copiază automat întregul genom și nu „vede” singură o boală. Rezultatul depinde de alegerea primerilor, de calitatea probei și de controale. Un test poate căuta o secvență a unui agent patogen sau o variantă genetică, dar interpretarea clinică cere context. Într-o schemă, marchează cele trei etape de temperatură și rolul fiecărei componente. Fără primer, ADN-polimeraza nu poate începe sinteza catenei noi. Lecțiile Electroforeza acizilor nucleici și Secvențierea ADN descriu metode folosite frecvent după amplificare, iar Acizii nucleici explică bazele complementare pe care se sprijină reacția.

Ciclul PCR cuprinde denaturare, hibridizarea primerilor și extensie. Amplificarea ideală este aproximativ exponențială în primele cicluri, dar eficiența reală scade din cauza limitărilor reacției. Specificitatea depinde de complementaritatea primerilor și de condițiile termice. Controalele pozitive și negative ajută la detectarea eșecului reacției și a contaminării. RT-PCR include o etapă de transcriere inversă când materialul inițial este ARN.

PCR repetă denaturarea ADN-ului, fixarea primerilor și extensia printr-o ADN-polimerază termostabilă. Dacă fiecare ciclu dublează ideal numărul moleculelor țintă, după trei cicluri dintr-o moleculă rezultă până la $2^3=8$ copii. În practică, eficiența nu este perfectă; un control negativ arată dacă reacția a fost contaminată.

Metoda a fost inventată de Kary Mullis (Premiul Nobel pentru chimie, 1993), iar utilizarea polimerazei termostabile de la bacteria Thermus aquaticus (Taq) a permis automatizarea. Reacția conține ADN-matriță, doi primeri (oligonucleotide de 18–25 de nucleotide, complementare capetelor regiunii de amplificat), cele patru dezoxiribonucleozid-trifosfați, ADN-polimerază termostabilă și tampon cu ioni de magneziu. Un ciclu are trei trepte: denaturarea la aproximativ 94–95 °C (separarea catenelor), hibridizarea primerilor la 50–65 °C și extensia la 72 °C, unde Taq adaugă aproximativ o mie de nucleotide pe minut. După $n$ cicluri, numărul de molecule este cel mult $2^n$, iar numărul moleculelor de lungime egală cu cea a regiunii țintă este $2^n-2n$. RT-PCR pornește de la ARN: o reverstranscriptază sintetizează întâi ADN complementar (ADNc); metoda este folosită pentru detectarea virusurilor cu genom ARN. PCR în timp real măsoară fluorescența la fiecare ciclu; numărul de cicluri la care semnalul depășește pragul (Ct) este cu atât mai mic cu cât proba conținea mai mult material-țintă.

Exemplu rezolvat 1: câte copii? Se pornește de la o singură moleculă-matriță.

1. După 10 cicluri: $2^{10}=1024$ copii.
2. După 20 de cicluri: $2^{20}=1048576$.
3. După 30 de cicluri: $2^{30}=1073741824$, adică aproximativ un miliard.
4. Dacă un ciclu durează 2 minute, 30 de cicluri durează 60 de minute. Moleculele de lungime exactă a țintei apar de la al treilea ciclu: din 8 molecule, $8-2\cdot 3=2$ au lungimea țintei.

Exemplu rezolvat 2: alegerea temperaturii de hibridizare. Pentru un primer cu 20 de nucleotide, dintre care 11 sunt G sau C, temperatura de topire estimată prin regula lui Wallace este $T_m=4(G+C)+2(A+T)$.

1. $T_m=4\cdot 11+2\cdot 9=44+18=62$ °C.
2. Temperatura de hibridizare se alege cu 5 °C sub $T_m$, deci aproximativ 57 °C.
3. Dacă temperatura este prea scăzută, primerii se leagă și la secvențe asemănătoare și apar produși neintenționați; dacă este prea mare, primerii nu se leagă. Controlul negativ (fără ADN) arată dacă reactivii sunt contaminați.

Contaminarea cu ADN din reacții anterioare poate da rezultate fals pozitive, de aceea pregătirea probelor și amplificarea se fac în spații separate.

Greșeli frecvente

• Greșit: PCR copiază la întâmplare tot ADN-ul probei.
  Corect: Primerii delimitează fragmentul amplificat.
• Greșit: Un rezultat PCR stabilește singur orice diagnostic.
  Corect: Rezultatul se interpretează în contextul probei, metodei și situației clinice.
• Greșit: PCR produce un număr de molecule care crește liniar cu numărul ciclurilor.
  Corect: Numărul crește exponențial, de până la $2^n$ după $n$ cicluri, apoi se saturează când reactivii se epuizează.

Înainte și după