Clonarea genelor

Clonarea unei gene înseamnă obținerea mai multor copii ale unei secvențe de ADN prin introducerea ei într-un vector, de exemplu o plasmidă, care se multiplică în celule gazdă. Cercetătorul selectează fragmentul, îl asociază cu vectorul și introduce construcția în celule. După multiplicare, poate izola ADN-ul sau poate folosi gena pentru producerea unei proteine. Această metodă este diferită de clonarea unui organism întreg.

Celulele care au primit plasmida sunt identificate și multiplicate. Inserarea unui fragment nu garantează automat că proteina dorită va fi produsă: sunt necesare secvențe de reglare potrivite, orientare corectă și condiții de exprimare. Într-un desen, urmărește secvența țintă, vectorul, celula gazdă și produsul final. Separă scopul de a obține multe copii de ADN de scopul de a produce o proteină. Lecțiile Amplificarea ADN prin PCR, Organismele modificate genetic și Vaccinurile cu antigene recombinate prezintă metode asociate și aplicații ale ADN-ului recombinant. La final, ADN-ul obținut poate fi folosit în cercetare ori pentru producerea unei substanțe utile.

Clonarea moleculară poate folosi enzime de restricție și ligază sau metode de asamblare fără restricție clasică. Vectorul include origine de replicare, marker de selecție și, pentru exprimare, promotor adecvat. Coloniile selectate trebuie verificate pentru prezența și orientarea inserției. Amplificarea prin PCR produce copii in vitro, în timp ce clonarea în plasmidă folosește replicarea celulelor gazdă.

Etapele clasice sunt tăierea ADN-ului și a plasmidei cu aceeași enzimă de restricție, unirea capetelor compatibile cu ADN-ligaza, introducerea plasmidei în bacterii (transformare) și selecția coloniilor cu marker, de exemplu rezistență la un antibiotic. Inserția se verifică ulterior, deoarece supraviețuirea pe mediu selectiv nu dovedește singură că secvența dorită este corectă.

Enzimele de restricție recunosc secvențe palindromice scurte. EcoRI recunoaște $5^{\prime }$-GAATTC-$3^{\prime }$ și taie între G și A, lăsând capete adezive cu proeminențe monocatenare de patru nucleotide (AATT). Capetele compatibile se asociază prin complementaritate, iar ADN-ligaza formează legăturile fosfodiesterice. O secvență de $k$ perechi de baze apare, în medie, o dată la $4^k$ perechi de baze; pentru EcoRI, $4^6=4096$. Un vector de clonare are origine de replicare, un loc cu mai multe situsuri de restricție, o genă de rezistență la antibiotic (marker de selecție) și, la unii vectori, gena lacZ pentru selecția albastru–alb: inserția întrerupe lacZ, iar coloniile cu inserție sunt albe pe mediu cu X-gal, în timp ce coloniile fără inserție sunt albastre.

Exemplu rezolvat 1: pașii unei clonări. O genă de 1 200 de perechi de baze este clonată într-o plasmidă de 3 000 de perechi de baze care are un singur situs EcoRI.

1. Gena (cu capete EcoRI) și plasmida se taie cu EcoRI; plasmida devine liniară cu capete adezive.
2. Ligaza unește gena cu plasmida: plasmida recombinantă are $3000+1200=4200$ de perechi de baze.
3. Bacteriile se transformă și se plasează pe mediu cu antibiotic și X-gal; supraviețuiesc doar bacteriile cu plasmidă (rezistența la antibiotic).
4. Coloniile albe conțin inserția; plasmidele lor se verifică prin tăiere cu EcoRI: gel cu două benzi, de 3 000 și 1 200 de perechi de baze.

Exemplu rezolvat 2: câte situsuri se așteaptă? ADN-ul fagului lambda are 48 502 perechi de baze.

1. Numărul mediu de situsuri EcoRI așteptat: $\frac{48502}{4096}\approx 11,8$.
2. În realitate, EcoRI taie ADN-ul lambda în 5 locuri, deci secvența nu este distribuită întâmplător.
3. Concluzie: frecvența teoretică $\frac{1}{4^k}$ este o estimare pentru secvențe întâmplătoare, dar secvențele reale sunt neuniforme; de aceea numărul de fragmente se verifică experimental.

După clonare, plasmida recombinantă poate fi izolată din bacterii prin liză alcalină și purificată; o singură bacterie transformată dă naștere unei colonii, adică unui clon cu plasmide identice. Un clon al genei este diferit de un clon al organismului: primul înseamnă copii ale unui fragment de ADN, al doilea un organism întreg cu același genom nuclear.

Greșeli frecvente

• Greșit: Clonarea unei gene creează un individ clonat.
  Corect: Clonarea genei produce copii ale unei secvențe ADN.
• Greșit: Inserarea unei gene în plasmidă garantează producerea proteinei.
  Corect: Expresia depinde de promotor, gazdă și alte condiții.
• Greșit: Coloniile bacteriene care cresc pe mediul cu antibiotic conțin sigur gena de interes.
  Corect: Ele conțin plasmida, cu sau fără inserție; prezența și orientarea inserției se verifică prin tăiere, PCR sau secvențiere.

Înainte și după